1999年，正式辭去公職，創辦阿里巴巴網站，開拓電子商務應用，尤其是B2B業務。目前，阿里巴巴是全球最大的B2B網站之一。阿里巴巴網站成功，使馬云多次獲邀到全球著名高等學府講學，當中包括賓夕法尼亞大學的沃頓商學院、麻省理工大學、哈佛大學等。